实验室和细胞工厂在细胞培养过程中，支原体污染一直是困扰我们的疑难杂症。据统计，常规细胞培养中支原体污染一般能达到30%，甚至更多，严重干扰了实验结果的可信度。因此，定期进行支原体检测和去除，确保细胞培养体系内无支原体存在才能获得准确有效的实验数据。

支原体是什么？

支原体是1898年Nocard等发现的一种类似细菌但不具有细胞壁的原核微生物，能在无生命的人工培养基上生长繁殖，直径50-300nm，能通过细菌滤器。支原体在过去曾称之为类胸膜肺炎微生物，1967年正式命名为支原体。

支原体又称霉形体，为目前发现的较小较简单的原核生物，基因数量为480。支原体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体。支原体通常依附在细胞膜表面，结构也比较简单，多数呈球形，没有刚性的细胞壁，因此很多抗生素对其不起作用。只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。实验室常见的种类有：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、发酵支原体、人型支原体、唾液支原体、肺支原体和梨支原体等。

支原体污染的原因是什么？

支原体污染一直是困扰实验室细胞培养的难题，其来源主要是有以下几个方面：

1. 细胞之间交叉污染；

2. 工作环境或实验器材的污染；

3. 实验者无菌操作不佳；

4. 培养基或其他试剂污染；

5. 制备细胞的原始组织或器官的污染；

支原体污染的危害是什么？

细胞培养中的污染类型很多，其中细菌和真菌造成的污染相对比较容易检测、预防和去除，然而支原体造成的污染很难察觉，即使生长密度高达10⁷~10⁹CFU/mL也很难有污染迹象（浑浊、pH变化等）。支原体污染后会导致细胞生长变慢，状态变差，不会马上使细胞致死，但会影响细胞内的各种参数，如改变细胞膜抗原性，改变细胞新陈代谢，干扰核酸的合成，改变DNA转染效率导致染色体畸变等。

支原体检测方法有哪些？

检测支原体的方法一般有分离培养法、指示细胞培养法（DNA染色法）、化学发光法（特异酶学检测）、ELISA法、PCR法。

1.  支原体分离培养法

支原体分离培养法是检测支原体的金标方法，其检测精确度较高。此方法非常经典，在世界范围内得到广泛认可，《中国药典》2020版第四部分3301和欧洲药典第六版2.6.7部分均有记载。这种方法是从可疑的细胞培养体系中取样，并接种到培养基灵敏度检查合格的支原体琼脂培养基上，如果样本中含有支原体，它们就会在支原体琼脂基上生长，较终形成明显可见的特征性菌落。

由于分离培养法基本不会出现假阴性结果，因此也被誉为支原体检测金标准。不过分离培养法也存在两个弊端，一是检测时间太长，支原体要在培养基上长出明显克隆需要4周左右，且操作也较复杂；二是尽管可以检测绝大多数的支原体种类，但也存在个别无法检测的情况，例如支原体M. hyorhinis。

2.  指示细胞培养法（DNA染色法）

指示细胞培养法是指将供试品接种于指示细胞（一般选择细胞质区域较大无污染的Vero细胞或经国家专业鉴定机构认可的其它细胞）中培养后，用特异荧光染料（如Hoechst染料）染色，然后在荧光显微镜下观察。如供试品有支原体污染，就可以在指示细胞表面观察到荧光斑点或荧光颗粒，与细胞核呈现的更大更亮椭圆形的荧光形成鲜明对比。

指示细胞培养法（DNA染色法）也是《中国药典》2020版第四部分3301认可的支原体检测方法，由于供试品要与指示细胞共同培养，因此也需要3~5天的时间。较大的优点就是较为快速，直观，但是它的灵敏度会比较低，在支原体污染不严重时容易得到模棱两可的结果，只有在污染严重时才能得到可靠度较高的结果。此外Hoechst染色试剂对人体有害，要注意防护；且固定液含有冰乙酸，有刺激性气味，需要在通风橱内进行固定操作；荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。

3.  化学发光法（特异酶学检测）

化学发光法的原理是利用支原体内特有的酶，与提供的底物相互作用，使其中的ADP转化为ATP，荧光素酶可以利用产生的ATP与荧光素酶底物发生反应，能产生可以被仪器检测到的光。如果没有支原体存在，荧光素酶就没有足够的ATP去发生反应产生光，仪器检测到的数值就比较低；如果有支原体存在，就可以使大量的ADP转化为ATP，供荧光素酶发生反应，产生大量的光，仪器检测到的数值就比较高。

这种方法的优点是检测的灵敏度高，速度快，但只能检测活的支原体。

4.  ELISA法

ELISA法也能用于支原体检测，以ELISA法为基础的支原体检测一般使用针对支原体16S rRNA基因的带标记探针或抗体，也有一些商品化的支原体Elisa试剂盒来检测培养物中是否含有支原体。

ELISA法是一种很考验操作者技术的检测方法，而且很依赖抗体，有一定局限性，无法对没有抗体或目前找不到抗体的支原体进行检测，而且稍不留意就容易出现实验误差。方法相对复杂，用得也比较少。但是特异性高，时间也比较短，3~5小时就可以观察结果。

5.  PCR法

PCR法也是目前较常用的方法，它的检测方式主要有凝胶电泳检测和荧光PCR定量检测。其原理都是在支原体16S rRNA基因的保守区设计引物，通过检测支原体DNA来检测细胞中有无支原体的污染。

在凝胶电泳过程中，支原体DNA会显示为特异性条带，以此指示支原体的存在。

在用荧光PCR定量扩增时，观察图谱及C_t值可判断是否有支原体存在。

PCR法的优点是检测灵敏度高，特异性好，检测速度快，可在几个小时内识别细胞培养物中是否有支原体污染。但存在测试过程中污染物易从阳性对照（或其他以前对支原体测试呈阳性的样品）传播到未受影响的样品的风险，从而导致假阳性结果，此外也不能判断灭活处理后的样品是否还有活的支原体。

支原体非常顽强，通常用于细胞培养的绝大多数抗生素都对其无效。无懈可击的细胞培养技术始终是预防支原体感染的较佳方式，另外及时找出受到支原体感染的培养物也很重要，这样才能在感染扩散前快速采取有效措施。

祝实验室各位小伙伴都能早日培养出自己心仪的细胞！